Sử dụng kỹ thuật PCR để nhân bản một đoạn gen đặc trưng của virus CMV kết hợp với việc bổ sung taqman probe - là một chất phát huỳnh quang vào phản ứng PCR. Dựa vào sự kiểm soát số lượng huỳnh quang tiêu tốn trong phản ứng cùng với các chuẩn ADN-CMV đã biết trước nồng độ, phần mềm của hệ thống sẽ tính toán và đếm được số lượng bản sao virus CMV ban đầu có trong mẫu bệnh phẩm.
I. NGUYÊN LÝ
Sử dụng kỹ thuật PCR để nhân bản một đoạn gen đặc trưng của virus CMV
kết hợp với việc bổ sung taqman probe - là một chất phát huỳnh quang vào phản
ứng PCR. Dựa vào sự kiểm soát số lượng huỳnh quang tiêu tốn trong phản ứng
cùng với các chuẩn ADN-CMV đã biết trước nồng độ, phần mềm của hệ thống sẽ
tính toán và đếm được số lượng bản sao virus CMV ban đầu có trong mẫu bệnh
phẩm.
II. CHỈ ĐỊNH
Xét nghiệm này chỉ định cho tất cả các người bệnh có biểu hiện nhiễm
trùng sau ghép.
III.CHỐNG CHỈ ĐỊNH
Không có chống chỉ định.
IV. CHUẨN BỊ
1. Người thực hiện
- Kỹ thuật viên xét nghiệm sinh học phân tử đã được đào tạo.
2. Phương tiện - Hóa chất
2.1. Phương tiện
- Hệ thống máy real-time PCR;
- Tủ hút hóa chất (chemical fume hood);
- Buồng vô trùng (biology cabinet);
- Máy ly tâm tốc độ cao (tốc độ tối đa 14.000 vòng/phút);
- Máy vortex;
- Các loại pipet 10 µl, 20 µl, 100 µl, 200 µl, 1000 µl;
- Đầu côn có màng lọc;
- Ống eppendorf 1,5 ml vô trùng, không có enzym nucleaza;
- Ống PCR 0,2 ml vô trùng, không có enzym nucleaza;
- Tủ lạnh 4-8
o
C, tủ âm sâu -20
o
C;
- Găng tay.
2.2 Hóa chất
198
- Sử dụng kit tách ADN thương mại. Nếu tách thủ công thì sử dụng các
sinh phẩm cần thiết để tách chiết ADN như proteinase K, đệm ly giải tế bào,
phenol/chloroform, cồn tuyệt đối.
- Kit
định lượng CMV thương mại hoặc các hóa chất cần thiết cho phản
ứng real-time PCR như probe, primer, dNTPs, enzym, các mẫu ADN chuẩn.
3. Bệnh phẩm
2 ml máu ngoại vi đựng trong ống chống đông EDTA.
4. Phiếu xét nghiệm
Có đầy đủ các thông tin cần thiết về người bệnh, về chẩn đoán và yêu cầu
xét nghiệm.
V. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
1. Lấy bệnh phẩm
2 ml máu ngoại vi chống đông bằng EDTA.
2. Tiến hành kỹ thuật
Bước 1: Tách chiết ADN
Xem bài “Tách chiết ADN từ máu ngoại vi”
Bước 2: Thực hiện phản ứng Real-time PCR
Chuẩn bị các mẫu chuẩn:
Để định lượng phải có tối thiểu 3 mẫu chuẩn (mẫu chuẩn là các mẫu ADN
đích đã biết trước nồng độ, thường sử dụng mẫu chuẩn ở 3 độ pha loãng liên
tiếp) và một mẫu đối chứng âm để kiểm soát ngoại nhiễm ((thường sử dụng H
2
0
đã khử các enzym phân hủy ADN và ARN hoặc đệm Tris- EDTA 1M, pH=7,5).
Chuẩn bị phản ứng:
- Ghi tên các ống theo thứ tự.
- Mỗi ống phản ứng bổ sung đủ các thành phần phản ứng:
+ Mẫu ADN + master mix theo nồng độ khuyến cáo (nếu sử dụng kit
định lượng chế tạo sẵn).
+ Mẫu ADN+ buffer+ enzym+ primer+ probe theo đúng nồng độ đã tối
ưu (nếu sử dụng các thành phần riêng lẻ).
- Đặt các ống phản ứng vào các vị trí trên máy.
Chuẩn bị chương trình trên máy
- Cài đặt sơ đồ giếng theo đúng các vị trí ống đã đặt trên máy, nhập thông
tin mẫu và các nồng độ mẫu chuẩn theo đúng yêu cầu, chọn kênh màu huỳnh
quang tương thích.
199
- Cài đặt chương trình chạy theo chế độ luân nhiệt khuyến cáo của kit
hoặc chế độ luân nhiệt đã tối ưu được.
- Chọn vị trí lưu kết quả sau khi kết thúc chương trình chạy.
- Bấm start để bắt đầu chạy theo chương trình đã chọn.
Bước 3: Phân tích kết quả
- Sau khi kết thúc chương trình chạy, tất cả các kết quả được hiển thị lên
màn hình.
- Kiểm tra các đường chuẩn và mẫu đối chứng âm trước.
+ Nếu đạt yêu cầu (theo hướng dẫn của kit sử dụng hoặc theo kết quả lý
thuyết đã tối ưu) thì tiếp tục phân tích các mẫu khác theo kết quả thu được.
+ Nếu không đạt yêu cầu (mẫu chuẩn không có tín hiệu huỳnh quang,
mẫu đối chứng âm bị nhiễm thành dương tính….) thì không đủ cơ sở để phân
tích các mẫu khác. Trong trường hợp này phải lặp lại xét nghiệm sau khi đã tìm
ra nguyên nhân sai sót ở xét nghiệm trước.
VI. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
- Số lượng virus CMV được hiển thị lên màn hình sau khi chạy, chú ý
nhân với hệ số pha loãng mẫu nếu trước đó có pha loãng mẫu để chạy.
VII. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
SAI SÓT XỬ TRÍ
§ Lấy mẫu không đủ hoặc sai
chất chống đông.
§ Thực hiện theo đúng hướng dẫn qui cách
lấy mẫu.
§ Thao tác pipet không chính
xác.
§ Sử dụng pipet theo đúng thể tích quy định.
§ Tín hiệu phản ứng không rõ
ràng.
§ Bảo quản hóa chất đúng theo khuyến cáo
của nhà sản xuất
§ Thực hiện đúng, đủ các bước trong quy
trình xét nghiệm.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Phạm Hùng Vân (2009). Real-time PCR. PCR và Realtime PCR - các vấn đề
cơ bản và các áp dụng thường gặp. Nhà xuất bản y học, trang 60-65.
2. A.Rolfs et at (1992). PCR:Clinical Diagnosis and Research. Springer Verlag,
Berlin.
