Kháng nguyên nDNA được gắn sẵn trong các giếng nhựa sẽ kết hợp với kháng thể đặc hiệu anti – nDNA IgG-IgM (nếu có) trong huyết thanh người bệnh khi ủ tạo nên phức hợp Kháng nguyên-Kháng thể đặc hiệu. Sau khi rửa bỏ huyết thanh thừa, cho chất cộng hợp (còn gọi là conjugate) có bản chất là hỗn hợp anti IgG và anti IgM người gắn enzym peroxidase. Khi đó cộng hợp sẽ gắn đặc hiệu vào phức hợp Kháng nguyên-Kháng thể (nếu có). Sau khi rửa bỏ lượng cộng hợp dư thừa không gắn với phức hợp Kháng nguyên-Kháng thể, cho tiếp vào giếng phản ứng một lượng xác định cơ chất TMB/H2O2 . Enzym peroxidase trong giếng phản ứng (nếu có) sẽ xúc tác tạo phản ứng giữa H2O2 và TMB tạo màu xanh lá cây. Phản ứng được ngừng lại bằng dung dịch a-xít H2SO4 loãng, lúc này màu xanh của dung dịch chuyển thành màu vàng chanh, đậm độ màu tương quan thuận với nồng độ kháng thể IgG và IgM có trong huyết thanh. Xác định mức độ màu bằng phương pháp đo mật độ quang (OD) ở bước sóng 450 nm hoặc bước sóng kép 450 nm/620 nm.

I. NGUYÊN LÝ
Kháng nguyên nDNA được gắn sẵn trong các giếng nhựa sẽ kết hợp với
kháng thể đặc hiệu anti – nDNA IgG-IgM (nếu có) trong huyết thanh người bệnh
khi ủ tạo nên phức hợp Kháng nguyên-Kháng thể đặc hiệu. Sau khi rửa bỏ huyết
thanh thừa, cho chất cộng hợp (còn gọi là conjugate) có bản chất là hỗn hợp anti
IgG và anti IgM người gắn enzym peroxidase. Khi đó cộng hợp sẽ gắn đặc hiệu
vào phức hợp Kháng nguyên-Kháng thể (nếu có). Sau khi rửa bỏ lượng cộng hợp
dư thừa không gắn với phức hợp Kháng nguyên-Kháng thể, cho tiếp vào giếng
phản ứng một lượng xác định cơ chất TMB/H
2
O
2
. Enzym peroxidase trong giếng
phản ứng (nếu có) sẽ xúc tác tạo phản ứng giữa H
2
O
2
và TMB tạo màu xanh lá
cây. Phản ứng được ngừng lại bằng dung dịch a-xít H
2
SO
4
loãng, lúc này màu xanh
của dung dịch chuyển thành màu vàng chanh, đậm độ màu tương quan thuận với
nồng độ kháng thể IgG và IgM có trong huyết thanh. Xác định mức độ màu bằng
phương pháp đo mật độ quang (OD) ở bước sóng 450 nm hoặc bước sóng kép 450
nm/620 nm.

II. CHỈ ĐỊNH

Các trường hợp nghĩ đến bệnh tự miễn.

III.CHỐNG CHỈ ĐỊNH

Không có chống chỉ định.

IV. CHUẨN BỊ

1. Người thực hiện
- Kỹ thuật viên và cử nhân đã được đào tạo thực hiện kỹ thuật;
- Bác sĩ xét nghiệm: đọc kết quả, đánh giá, kiểm tra chất lượng.
2. Phương tiện - Hóa chất
2.1. Phương tiện
- Máy ly tâm ống máu.

92
- Pipet và đầu pipet loại 25µl và 1000µl.
- Dàn máy ELISA (tự động hoặc bán tự động).
- Găng tay.
2.2. Hóa chất
Kít định tính nDNA IgG/IgM gồm các thành phần sau:
- Dung dịch pha loãng mẫu;
- Dung dịch rửa;
- Chứng âm (negative control);
- Chứng dương (positive control);
- Chứng ngưỡng (cut-off calibrator);
- Các nồng độ kháng thể chuẩn (calibrator): thường có 6 nồng độ chuẩn,
giá trị cụ thể của các ống nồng độ chuẩn tùy thuộc vào hãng sản xuất;
- Dung dịch cộng hợp (conjugate): 1 lọ cộng hợp gồm cả IgG và IgM
dùng để phát hiện kháng thể IgG và IgM;
- Cơ chất tạo mầu (TMB substrate);
- Dung dịch dừng phản ứng (stop solution);
- Các giếng phản ứng trên phiến nhựa ELISA;
- Nước cất, hoá chất khử trùng Natri hypoclorite.
3. Mẫu bệnh phẩm
- Mẫu dùng là huyết thanh;
- Cần tách huyết thanh càng sớm càng tốt để tránh hiện tượng tan máu
làm ảnh hưởng đến kết quả phản ứng;
- Nếu có lẫn hồng cầu hoặc những thành phần hữu hình trong mẫu huyết
thanh thì cần ly tâm mẫu để loại bỏ các thành phần đó trước khi xét nghiệm;
- Mẫu huyết thanh bảo quản ở nhiệt độ 2
o
C đến 8
o
C có thể dùng làm xét
nghiệm trong vòng 7 ngày. Nếu muốn để lâu hơn mới xét nghiệm cần phải bảo
quản ở tủ lạnh sâu (≤ -20
o
C). Tuy nhiên với mẫu bảo quản lạnh sâu cần tránh
đông-tan nhiều lần.

V. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

1. Pha loãng mẫu 100 lần bằng dung dịch pha loãng mẫu (cung cấp theo
kít).
2. Nhỏ 100µl các nồng độ chuẩn (calibrator), mẫu chứng âm, chứng
dương, các mẫu thử vào các giếng trên phiến theo sơ đồ định sẵn.
3. Ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng.

93
4. Rửa 3 lần bằng dung dịch rửa, 300µl /giếng/lần.
5. Nhỏ 100µl cộng hợp (conjugate) vào các giếng.
6. Ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng.
7. Rửa 3 lần bằng dung dịch rửa, 300µl /giếng/lần.
8. Nhỏ 100µl cơ chất tạo mầu (TMB subtrate) vào mỗi giếng.
9. Ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng.
10. Nhỏ 100µl dung dịch dừng phản ứng (stop solution) vào mỗi giếng
theo đúng trình tự nhỏ TMB.
11. Ủ tối thiểu 5 phút. Gõ nhẹ vào thành giếng trong 5 giây để trộn đều.
12. Đọc phiến ở bước sóng 450/

tham khảo